PRODUCT CLASSIFICATION
產(chǎn)品分類(lèi)技術(shù)文章/ Technical Articles
ELISA法對(duì)IgG、IgM都有很好的檢測(cè)能力,因其靈敏度高,價(jià)格低廉,操作方便,結(jié)果客觀,在國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)室廣泛應(yīng)用,但在工作中遇到的大的問(wèn)題是出現(xiàn)假陽(yáng)性的問(wèn)題。影響因素除了方法學(xué)、試劑盒本身之外,還有標(biāo)本處理、操作不當(dāng)?shù)榷喾N因素,雙試劑兩組結(jié)果進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn),差異(P>0.05)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
多種因素可能會(huì)導(dǎo)致ELISA法本底偏高。出現(xiàn)灰值,除了嚴(yán)格操作、做好質(zhì)控外,對(duì)可疑假陽(yáng)性的標(biāo)本一定要認(rèn)真復(fù)測(cè)。為避免假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn)現(xiàn)將產(chǎn)生假陽(yáng)性的原因分析如下:
?內(nèi)源性因素
?年齡因素
老年人容易出現(xiàn)免疫功能異常,產(chǎn)生一些異常蛋白質(zhì)干擾了檢測(cè)的結(jié)果出現(xiàn)假陽(yáng)性。
?疾病因素
類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡、糖尿病、自身免疫性疾病等可使患者體內(nèi)含有嗜異性抗體,自身抗體、類(lèi)風(fēng)濕因子等,這些特殊成分在反應(yīng)過(guò)程中有一定的吸附作用,多為體內(nèi)某些抗原物質(zhì)干擾所致產(chǎn)生假的顯色反應(yīng)而出現(xiàn)假陽(yáng)性。
?標(biāo)本因素
?標(biāo)本處理不*
血液抽出后未*凝固而離心分離血清不能使纖維蛋白原*析出,加樣后板孔中形成纖維蛋白薄膜或絮狀物,造成洗板不*干凈,酶殘留在反應(yīng)孔中,使反應(yīng)孔吸光度值偏高,出現(xiàn)假陽(yáng)性,待測(cè)血清中混有纖維蛋白原,這種物質(zhì)易沉淀或附著在聚乙烯空內(nèi)不易洗凈,試驗(yàn)表明在較高的離心轉(zhuǎn)速(3000/min)和較長(zhǎng)的離心時(shí)間(>10/min)之上,血液標(biāo)本被充分地離心分離后,使紅細(xì)胞和纖維蛋白充分沉淀,可以在加樣時(shí)避免加入這兩種干擾物質(zhì)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響。檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)網(wǎng)
?標(biāo)本溶血
標(biāo)本溶血時(shí)細(xì)胞內(nèi)液的各種活性酶以及具有酶活性的物質(zhì)與底物非特異性結(jié)合,洗滌時(shí)不易洗去,催化底物產(chǎn)生一定的顯色反應(yīng),使本底吸光度值偏高形成假陽(yáng)性。
?細(xì)菌污染
標(biāo)本放置、處置不當(dāng)被細(xì)菌污染,一些細(xì)菌體內(nèi)可能含有內(nèi)源性辣根過(guò)氧化物酶會(huì)對(duì)相應(yīng)的酶做標(biāo)記的測(cè)定方法產(chǎn)生非特異性干擾,造成弱的假陽(yáng)性反應(yīng)。
?操作因素
聚苯乙烯因其具有較長(zhǎng)的吸附蛋白質(zhì)的性能而被廣泛用于ELISA試驗(yàn)的固相載體,聚苯乙烯等塑料對(duì)蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的,因此需要通過(guò)洗滌清楚在反應(yīng)過(guò)程中,非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì),洗滌在ELISA過(guò)程中雖不是一個(gè)反應(yīng)步驟,但卻決定著試驗(yàn)的成敗,可以在加樣前離心時(shí)得以控制,同樣也可以通過(guò)適當(dāng)增加洗滌的次數(shù)和浸泡時(shí)間減輕或避免對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響,同樣對(duì)于血液存在的非特異性的lgG的樣本很難在加樣時(shí)將其去除,那么解決的時(shí)機(jī)就是洗滌過(guò)程。
1、加樣太快,加樣時(shí)加在孔壁上或有氣泡。
2、底物液反復(fù)使用被污染或被強(qiáng)光照射時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。
3、板要平整,尤其是在洗板機(jī)洗板的過(guò)程中,往往是3排一起洗,如果板不平,就很可能造成洗液有殘留,從而導(dǎo)致非特異性結(jié)合不能清除干凈,對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成干擾。
4、洗液溫度 實(shí)驗(yàn)表明:洗液溫度也會(huì)影響洗板的干凈程度,尤其是冬天溫度過(guò)低時(shí)容易出現(xiàn)“花板”問(wèn)題,因此,保持在室溫在20-30℃。
5、洗液未注滿(mǎn)孔,孔壁洗滌不干凈也易造成假陽(yáng)性現(xiàn)象。
6、洗液要新鮮配置,洗液要臨用前新鮮配置,放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)易產(chǎn)生絮狀物或渾濁,造成賭孔導(dǎo)致假陽(yáng)性。檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)網(wǎng)
7、洗板次數(shù)不夠或洗滌間隔時(shí)間過(guò)短也會(huì)造成由于洗板不凈而造成假陽(yáng)性,孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)也會(huì)造成假陽(yáng)性;由于樣本較多,加樣后未及時(shí)放入孵育箱,反應(yīng)板在室溫呆的時(shí)間過(guò)長(zhǎng),既間接增加了孵育時(shí)間,導(dǎo)致孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。
?儀器因素
?酶標(biāo)儀是垂直對(duì)反應(yīng)孔比色,反應(yīng)孔底部污染時(shí),出現(xiàn)反應(yīng)孔吸光度值偏高。檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)網(wǎng)
?洗板拖尾現(xiàn)象,洗板機(jī)在洗板過(guò)程中,出水針出水不暢,滴滴答答不間斷出現(xiàn)水滴,造成板上水過(guò)多,拍板不干凈。
?方法學(xué)因素
? 廠(chǎng)家試劑盒,由于不同廠(chǎng)家的診斷試劑所包被的抗原配比以及抗原純度不盡一致,造成靈敏度和特異性不同,因此也造成了假陽(yáng)性的產(chǎn)生。三代免疫試劑盒只檢測(cè)抗體,被某些身體不明抗原干擾,導(dǎo)致的假陽(yáng)性。
? 實(shí)驗(yàn)灰區(qū),在陽(yáng)性與陰性之間有一條明顯的分界線(xiàn),作為陽(yáng)性判定值(cutoff)來(lái)判定結(jié)果,一般把檢測(cè)值S/COV值在0.6-1范圍內(nèi)時(shí)作為灰區(qū)帶,因此當(dāng)1<S /CO≤0.6時(shí),真反應(yīng)性顯色的可能性小,多為體內(nèi)某些抗原物質(zhì)干擾所致,實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)人員應(yīng)依據(jù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果,結(jié)合受檢者相應(yīng)病史和個(gè)體狀況進(jìn)行綜合分析,應(yīng)進(jìn)行確認(rèn)實(shí)驗(yàn),避免判定假陽(yáng)性。
? “鉤狀效應(yīng)”的產(chǎn)生,需對(duì)標(biāo)本進(jìn)行稀釋重復(fù)檢測(cè)。
? 酶標(biāo)儀的波長(zhǎng)選擇,建議酶標(biāo)儀比色時(shí)選擇雙波長(zhǎng),即敏感波長(zhǎng)(主波長(zhǎng))和非敏感干擾波長(zhǎng)(次波長(zhǎng)),后從儀器上得到的讀數(shù)為敏感波長(zhǎng)與非敏感干擾波長(zhǎng)之差,排除(板孔的劃痕、污跡)干擾。
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